Головна сторінка

Предназначение



Скачати 218.73 Kb.
НазваПредназначение
Дата конвертації27.03.2016
Розмір218.73 Kb.
ТипАнализ

Паратиреоидный гормон (целая молекула) (EIA-3645)

Предназначение.


DRG Intact-PTH ИФА предназначен для количественного определения целой молекулы паратиреоидного гормона в сыворотке человека. Для диагностики in vitro.

Краткая информация о гормоне


ПТГ (Паратиреоидный гормон, Паратгормон, Паратирин) синтезируется околощитовидной железе как пре-пропаратиреоидный гормон, большая молекула-прекурсор, состоящая из 115 аминокислот. Пройдя цепь последовательных внутриклеточных превращений, от молекулы отщепляются 25 аминокислот, делая из нее 90-аминокислотную промежуточную полипептидную молекулу пропаратиреоидного гормона. После дальнейших протеолитических преобразований пропаратиреоидный переходит в паратиреоидный гормон, 84-аминокислотный полипептид. У здоровых людей регулирование секреции ПТГ обычно осуществляется по принципу отрицательной обратной связи кальция в крови на околощитовидную железу. Целая молекула ПТГ биологически активна и выводится из сосудистого русла очень быстро: период полураспада – менее 4 минут. ПТГ подвергается протеолизу как в околощитовидной железе, так и, по большей части, на периферии, а именно, в печени, почках и костях, давая N-терминальные фрагменты, более долгоживущие С-терминальные фрагменты и фрагменты середины молекулы. Касательно почечной недостаточности, анализы на С-терминаль и среднефрагментный ПТГ обычно дают завышенные результаты по ПТГ, как показатель нарушенного почечного клиренса.

Клиническая значимость


Анализ целой молекулы ПТГ важен для дифференциации первичного гиперпаратиреоидизма от других (непаратиреоид-опосредованных) форм гиперкальциемии, например, злокачественных новообразований, саркоидоза, тиреотоксикоза. Измерение ПТГ – это самый специфичный путь постановки диагноза первичного гиперпаратиреоидизма. В присутствии гиперкальциемии повышенный уровень ПТГ виртуально раскрывает диагноз. У порядка 90% пациентов с первичным гиперпаратиреоидизмом уровень ПТГ повышен.

Самая частая другая причина гиперкальциемии, а именно гиперкальциемии злокачественных новообразований, связана с заниженными уровнями ПТГ в пределах нормальной концентрации. Когда целая молекула ПТГ сравнивается на графике с уровнем кальция в крови, концентрация целой молекулы ПТГ у пациентов с гиперкальциемией злокачественных новообразований почти всегда подозрительно низка на фоне повышенного уровня кальция в крови.

В отличии от С-терминали и среднефрагментного ПТГ, которые обычно резко повышаются при почечной недостаточности, анализ целой молекулы ПТГ менее подвержен влиянию почечной недостаточности.

Значения ПТГ обычно неопределимы при гипокалиемии вследствие полного гипопаратиреоидизма, но они в норме, если гипокалиемия вызвана частичной потерей или снижением паратиреоидной функции.

Принцип Анализа.


DRG® Целая молекула PTH - твердофазный иммуноферментный анализ для измерения биологически интактной 84-аминокислотной цепочки паратиреоидного гормона. Два различных овечьих антитела к паратиреоидному гормону человека (ПТГ) были очищены методом аффинной хроматографии на специфичность к определенным участкам молекул ПТГ. Одно (биотинилированное) антитело связывается только со средними участками и С - концевой частью белка ПТГ 39-84. Другое антитело (с меткой пероксидазы хрена [HRP] для обнаружения) связывается только с N- концевой частью белка PTH 1-34.

Хотя средний участок и фрагменты C-концевой части связаны с биотинилированным антителом - ПТГ (39-84), только целый ПТГ 1-84 формирует двухсторонний комплекс («сэндвич»), необходимый для детекции. Биотинилированное антитело и лунки, покрытые стрептавидином, показывают незначительную интерференцию неактивных фрагментов, даже при сильно завышенных их уровнях. В ходе данного анализа калибраторы, контроли, образцы пациентов одновременно инкубируются с антителами с ферментной меткой и с биотинилированными антителами в лунках, покрытых стрептавидином. После инкубации лунки промываются с целью удаления несвязанных компонентов и фермент, связанный с твердой фазой инкубируется с субстратом ТМБ. Затем добавляется стоп-раствор (к-та) для остановки реакции, содержимое лунок при этом приобретает желтое окрашивание. Интенсивность желтого окрашивания прямо пропорциональна концентрации исходного ПТГ в образце. Строится кривая зависимости концентрации от единиц абсорбции по результатам, полученным при измерении калибраторов. Концентрации исходного ПТГ контролей и образцов пациентов определяются по этой кривой.

Компоненты набора


КОМПОНЕНТЫ НАБОРА

ОПИСАНИЕ

КОЛИЧЕСТВО

Реагент 1

биотинилированные антитела к ПТГ

1 x 7,0 мл

Реагент 2

антитела к ПТГ с меткой пероксидазы хрена (ферментной)

1 x 7,0 мл

Реагент B

ТМБ субстрат (тетраметилбензидин)

1 x 20 мл

Реагент 3

лошадиная сыворотка (раствор для разведения образцов пациента для считываний вне диапазона)

1 x 2 мл

Реагент A

промывочный концентрат (соляной раствор с ПАВ)

1 x 30 мл

Стоп раствор

Раствор, останавливающий реакцию (1Н серная к-та)

1 x 20 мл

Реагент 4

Восстановительный раствор с ПАВ

1 x 5 мл

Микропланшеты

1 держатель со стрипами, покрытыми стрептавидином

12х8-лун.

Калибраторы

A: 0 пг/мл

B, С, D, E, F – см. этикетку

Лиофилизированные с синтетическим h-PTH.

Все другие калибраторы состоят из синтетического h-ПТГ (1-84) в растворе БСА с овечьей сывороткой

1 x 0,5 мл на каждый уровень

Контроли 1 и 2 – см. этикетку

Лиофилизированы. 2 уровня. Синтетический h-ПТГ (1-84) в растворе БСА с овечьей сывороткой

1 x 0.5 мл на каждый уровень
Дополнительно требуемые компоненты:


• микропланшетный ридер

• автомат для промывки лунок (если нет в наличии, приемлема промывка вручную)

• прецизионные пипетки на 25, 100 и 150 мкл.

(опционно): многоканальная пипетка на 50, 100 и 150 мкл.

Предупреждения и меры предосторожности для пользователей:


Реагенты набора не содержат компонентов человеческой крови. С образцами пациентов, которые могут иметь положительную реакцию на поверхностный антиген гепатита В, капсидный антиген гепатита В или антитела к ВИЧ, необходимо обращаться как с потенциально биологически опасными. Необходимо соблюдать обычные меры предосторожности при работе с нетестированными образцами. Стоп-раствор состоит из 1Н серной кислоты. Это сильная кислота. Обращаться с осторожностью во избежание ожогов (использовать перчатки и защиту для глаз). В случае разливания немедленно смыть большим количеством воды. Не вдыхать испарения!

Забор и хранение проб.


Определение целой молекулы ПТГ должно выполняться с использованием ЭДТА плазмы или сыворотки. ЭДТА плазма имеет большую стабильность ПТГ по сравнению с сывороткой. Для парного исследования проб требуется 50 мкл сыворотки или ЭДТА плазмы. Отобрать цельную кровь без антикоагулянта или лавандовой (ЭДТА) трубки. После свертывания крови необходимо надлежащим образом отделить сыворотку или плазму, предпочтительно в охлаждаемой центрифуге. Хранить при -20oC или ниже. Образцы сыворотки могут храниться до 8 часов при 2-8°C. Замороженные образцы сыворотки (-20°C) стабильны до 4 мес.

Подготовка реагентов и их хранение.


Хранить все компоненты набора при 2-8°C за исключением концентрата для промывки и стоп-раствора после получения перед использованием.

  1. Все реагенты кроме калибраторов, контролей и промывочого концентрата, готовы к использованию. Хранить все реагенты при 2-8°C, кроме промывочного концентрата, который нужно хранить при комнатной температуре до разведения выпадения осадка.

  2. Для каждого калибратора (калибраторы А-F) и контролей 1 и 2, восстановить каждый флакон, добавив 500 мкл реагента 4 (восстановительный раствор) и смешать. Дать отстояться 10 минут, затем тщательно перемешать до полного восстановления. Использовать калибраторы и контроли немедленно после восстановления. Оставшиеся калибраторы и контроли заморозить (-20 ºC) как можно скорее после использования. Стандарты и контроли стабильны при -20°C 6 недель после восстановления. Допускается до 3 размораживания при условии обращения с реагентами согласно инструкций в п. «Замечания по проведению анализа».

  3. Реагент A: промывочный концентрат: тщательно перемешать содержимое флакона. При наличии осадка в промывочном концентрате вследствие длительного хранения при низкой температуре, напр. 4°C, растворить осадок на водяной бане при температуре 37°C или в сушильном шкафу при постоянном помешивании. Добавить промывочный концентрат (30 мл) - 570 мл дистиллированной или деионизированной воды и перемешать. Разведенный рабочий промывочный раствор стабилен 90 дней при комнатной температуре.

Процедура анализа.


  1. Поместить в держатель количество лунок со стрептавидином необходимое для использования всех (6) ПТГ калибраторов, A – F калибраторов ПТГ [точные концентрации указаны на этикетке флакона], контрольных плазм, образцов пациентов.

  2. Раскапать 25 мкл проб в помеченные лунки. Заморозить (-20ºC) оставшиеся калибраторы и контроли как можно скорее после использования.

  3. Добавить 50 мкл реагента 1 (биотинированное антитело) в каждую лунку с пробой.

  4. Добавить 50 мкл реагента 2 (антитело с ферментной меткой) в те же лунки. Накрыть планшету алюминиевой фольгой или поддоном, чтобы предотвратить попадание света, поместить в орбитальный шейкер (170 +10 об/мин) на 3 часа ± 30 минут при комнатной температуре(22°-28°C).

  5. Сначала аспирировать жидкость, затем промыть каждую лунку 5 раз рабочим промывочным раствором (приготовленным из реагента А), используя автомат для промывки лунок. Удалить остатки влаги, положив планшету на впитывающий материал. Объем промывочного раствора должен быть достаточным для использования 0.35 мл на каждую лунку.

  6. Добавить 150 мкл реагента B (TMB субстрата) в каждую лунку.

  7. Избегая попадания света, поместить планшеты в орбитальный шейкер при 170 + 10 об/мин на 30 ± 5 минут при комнатной температуре. (22°-28°C).

  8. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Осторожно перемешать.

  9. Считать абсорбцию раствора в лунках в течение 10 минут, с помощью микропланшетного ридера, установленного на 450 нм против 250 мкл дистиллированной или деионизированной воды. Считывать лунки снова при 405 нм против дистиллированной или деионизированной воды.

Примечание: второе считывание рассчитано на то, чтобы расширить калибровочную кривую до значения максимального калибратора, прибл. 700-1,000 пг/мл. Следовательно, значения образцов пациентов с ПТГ > 200 пг/мл могут быть определены по калибровочной кривой построенной по результатам считываний вплоть до концентрации эквивалентной максимальному калибратору при считывании на 405 нм, без учета длины волны максимальной абсорбции.

Пробы и контроли необходимо считывать при 450 нм для концентраций ПТГ до 200 пг/мл. Концентрации ПТГ выше 200 пг/мл должны интерполироваться при считывании на 405 нм.

  1. Используя итоговые значения абсорбции, полученные на предыдущем этапе, построить калибровочную кривую по способу кубического сплайна, 4-параметровой логистики, или поточечной интерполяции для вычисления концентрации ПТГ.

Замечания по проведению анализа.


    • ПТГ 1-84 – крайне нестабильная молекула. Проводить исследование необходимо сразу после восстановления или оттаивания всех калибраторов, контролей, и образцов пациентов.

    • Все калибраторы, контроли и образцы пациентов рекомендуется исследовать попарно. Для редакции данных и подсчета результатов используется среднее значение абсорбции.

    • Образцы необходимо пипетировать в лунки не допуская появления пузырьков воздуха. Для этого

    • нужно использовать «обратную пипетку» согласно инструкции производителя пипеток.

    • Образцы пациентов со значениями, превышающими максимальный калибратор (F), прибл. 700-1,000 пг/мл (точная концентрация указана на этикетке флакона), могут быть разведены реагентом 3 (раствор для разведения образцов) и исследованы повторно. Результат умножить на коэффициент разведения.

    • Недопустимо использование реагентов из разных лотов.

    • При необходимости смешайте равные объемы, достаточные для проведения исследования, реагентов 1 (биотинилированное антитело) и 2 (антитело с ферментной меткой) в чистом желтом флаконе, затем добавить 100 мкл смешанных антител в каждую лунку. Эти действия заменяют этап (3) и (4), затем следует инкубация в орбитальном шейкере.

Подсчет результатов


Метод «Вручную»

  1. По результатам считывания при 450 нм, построить калибровочную кривую используя первые пять калибраторов: калибраторы A, B, C, D и F. По результатам считываний при 405 нм, построить вторую калибровочную кривую, используя три калибратора с самыми высокими концентрациями, т.е. калибраторы D, E и F.

  2. Приписать концентрацию, указанную на флаконе, каждому калибратору, в пг/мл. Нанести данные калибровочной кривой на миллиметровую бумагу с концентрацией на оси X- и соответствующей величину поглощения на оси Y.

  3. Соединить прямой две соседние точки. Этот математический алгоритм называется поточечным расчетом. Концентрацию образца можно получить, отложив значение абсорбции на оси Y и найдя соответствующую концентрацию на оси X. Образцы пациентов и контролей нужно считывать при длине волны 450 нм для концентраций ПТГ до 200 пг/мл. Концентрации ПТГ более 200 пг/мл должны интерполироваться, используя данные считывания при 405 нм.

Автоматический метод:


Компьютерные программы, использующие кубический сплайн или 4 PL [4 – параметровая логистика] могут также применяться.

Значение образца при 450 нм.

Микропланшетные

лунки

1 считывание

величина ОП

2 считывание

величина ОП

Средняя

Величина ОП

Целый ПТГ

Пг/мл

Целый ПТГ пг/мл

Результат для отчета

Калибратор A

0,020

0,016

0,018




0

Калибратор B

0,056

0,051

0,054




7

Калибратор C

0,124

0,119

0,122




18

Калибратор D

0,388

0,393

0,391




55

Калибратор E

1,335

1,340

1,338




210

Контроль 1

0,200

0,200

0,200

27,6

27,6

Контроль 2

0,804

0,794

0,799

119

119

Образец пациента 1

0,147

0,136

0,142

19,1

19,1

Образец пациента 2

0,407

0,409

0,408

58,5

58,5

Образец пациента 3

2,375

2,454

2,415

> 200

*

Образец пациента 4

3,725

3,725

3,725

> 200

*

Так как считывание концентрации > 200 пг/мл, рекомендуется использовать значение, полученное при 405 нм, как показано в Значении образца при 405 нм в нижеприведенной таблице:

Значение образца при 405 нм.

Микропланшетные

лунки

1 считывание

величина ОП

2 считывание

величина ОП

Средняя

Величина ОП

Целый ПТГ

Пг/мл

Целый ПТГ пг/мл

Результат для отчета

Калибратор A

0,014

0,008

0,011




0

Калибратор D

0,124

0,128

0,126




55

Калибратор E

0,428

0,425

0,427




210

Калибратор F

1,309

1,317

1,313




700

Контроль 1

0,074

0,066

0,070

< 200




Контроль 2

0,260

0,251

0,256

121

121

Образец пациента 1

0,049

0,043

0,046

< 200




Образец пациента 2

0,132

0,133

0,133

< 200




Образец пациента 3

0,758

0,782

0,770

401

401

Образец пациента 4

1,314

1,321

1,318

> 700




Для образцов с результатом считывания < 200 пг/мл, рекомендуется использовать данные, полученные при 450 нм, как показано в примере "значение образца при 450 нм" в.у. таблицы. Такая практика дает результаты при оптимальной чувствительности анализа. При результате Контроля (2) < 200 пг/мл, рекомендуется считать и записать фактический результат для последующего контроля качества. Абсорбция Контроля 2 достаточно высока, чтобы считаться действительной при анализе. Если показатель абсорбции вне допустимых пределов или выше средней абсорбции максимального калибратора, образец необходимо развести и повторить считывание.

ПРИМЕЧАНИЕ: данные представлены в качестве иллюстрации и не должны использоваться вместо данных, полученных в ходе анализа.

Контроль качества.


контрольная сыворотка должна исследоваться при каждом исследовании калибраторов и образцов пациентов. Результаты исследования контрольных образцов на приемлемость должны оцениваться с использованием соответствующих статистических методов. Если при исследовании результаты контрольных образцов находятся вне допустимого диапазона, результаты образцов пациентов могут быть недействительны.

Ограничения процедуры


Набор PTH ELISA не показал “эффекта крюка высокой дозы” при исследовании образцов с 2,100,000 пг/мл целого ПТГ. Образцы с уровнями целого ПТГ выше максимального калибратора должны быть разведены и исследованы повторно. Образцы с уровнями целого ПТГ выше, чем наивысший калибратор, должны быть разведены и заново протестированы для получения правильных значений. Как и любой другой аналит, используемый в диагностике, целый ПТГ должен рассматриваться очень аккуратно на фоне клинической картины, как и другие вспомогательные методы анализа.

Ожидаемые значения.


Уровни несвязанного ПТГ были измерены у 137 здоровых пациентов в США с помощью DRG Intl. PTH ELISA. Полученные значения колебались от 9,4 до 81,6 пг/мл для сыворотки и от 11,1 до 95,9 для ЭДТА-плазмы. Основанная на статистических исследованиях асимметрии и эксцесса, популяция, трансформируясь логарифмически, следует нормальному распределению Гаусса как показано в гистограммах. Геометрическое значение стандартных отклонений ± 2 от среднего значения было подсчитано в пределах 13,9 до 75,1 пг/мл (сыворотка), а также от 16,6 до 83,4 пг/мл (ЭДТА-плазма).

Характеристики

Точность


233 пациента со значениями целого ПТГ 7,5 – 1046 пг/мл были протестированы на предшествующем наборе DRG PTH, а также на новом DRG PTH. Анализ линейной регрессии дает следующую статистику.

frame2

Чувствительность


Чувствительность, или минимальный определяемый уровень как наименьшее отдельное значение, определяемое от нуля при доверительном пределе 95%. Расчетная чувствительность равна 1.72 пг/мл.

Специфичность и кросс-реактивность


Антитела, используемые в наборе DRG PTH ELISA, были очищены аффинной хроматографией для достижения более свысокой специфичности с хорошо определяемым регионам молекулы ПТГ. Меченное пероксидазой антитело распознает только N-терминальную область или последовательность 1-34 аминокислот молекулы ПТГ, в то время как биотинилированное антитело специфично к сегменту 39-84. Cоответственно, с помощью реагентов данного набора обнаруживается только исходный ПТГ, который связывается с антителами с ферментной меткой, а также с биотинилированными антителами. Для более высокой специфичности данного набора, коньюгация и биотинизация и их молярное отношение, были оптимизированы для минимизации определения фрагментов ПТГ Человеческий PTH 1-34 при уровнях до 300 пг/мл и C -концевая часть 39-84 при уровнях до 300,000 пг/мл дают молярную кросс-реактивность с ПТГ менее 2% и 0.02% соответственно.

Точность и воспроизводимость.


Точность (вариации внутри постановкт) PTH ELISA рассчитывалась по 25 репликатам по каждому из 2 образцов.

Вариации внутри постановки

Образец

Среднее значение (пг/мл)

Число анализов

Коэффициент вариации (%)

A

47,7

25

3,0

B

265,0

25

2,8

Общая точность (вариации между постановками) PTH ELISA рассчитывалась по 21 разным анализам по каждому из 2 образцов 3 людьми в наборах из двух разных лотов в течение трех недель.

Вариации между постановками

Образец

Среднее значение (пг/мл)

Число анализов

Коэффициент вариации (%)

A

52,6

21

5,1

B

272,0

21

5,5

Восстановление:


Различные количества ПТГ были добавлены к трем сывороткам пациентов для определения восстановления. Результаты описаны в таблице:

Образец сыворотки

ПТГ эндогенный

(пг/мл)

ПТГ добавленный

(пг/мл)

Ожидаемые значения

(пг/мл)

Полученные значения

(пг/мл)

Восстановление

(%)

A

51,1

51,2

51,0

132

264

396

183

315

447

185

320

453

101%

102%

101%

B

306

310

312

132

264

396

438

574

708

415

523

632

95%

91%

89%

C

279

282

280

132

264

396

411

546

679

390

501

613

95%

92%

90%

Линейность разведений образцов пациентов: параллелизм


4 образца пациента разводились реагентом 4. Результаты в пг/мл представлены ниже:

Образец

Разбавитель

Ожидаемое

Наблюдаемое

% ожидаемого к наблюдаемому

A

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

-

208

104

52

415

175

89

51,5

-

84%

86%

99%

B

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

-

300

150

75

600

281

134

76

-

94%

89%

101%

C

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

-

344

172

85,9

687

335

169

87,7

-

97%

98%

102%

D

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

-

283

142

70,8

566

255

121

67

-

90%

85%

95%

Список литературы


  1. Segre, G.V., Niall H.D., Habener J.F. et. al. : Metabolism of parathyroid hormone: physiological and clinical significance. Am. J. Med. 56: 774,1974.

  2. Mallete, L.E., Gagel, R.F.: Parathyroid Hormone and Calcitonin. In: Murray J.F. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Society for Bone and Mineral Research, Kelseyville; William Byrd Press, Richmond, pp. 65-69, 1990.

  3. Bilezikian, J.P.: Primary Hyperparathyroidism. In: Murray J.F. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Society for Bone and Mineral Research, Kelseyville; William Byrd Press, Richmond, pp. 109-111, 1990.

  4. Stewart, A.F.: Humoral Hypercalcemia of Malignancy. In: Murray J.F. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Society for Bone and Mineral Research, Kelseyville; William Byrd Press, Richmond, pp. 115-118, 1990.

  5. Mallette, L.E.: The parathyroid polyhormones: New concepts in the spectrum of peptide hormone action. Endocrin. Rev. 12:110-117, 1991.

  6. Kruger, L.., Rosenblum, S., Zaazra, J. and Wong, J. Intact PTH is stable in unfrozen EDTA plasma for 48 hours prior to laboratory Analysis. Clin. Chem. 41:6: page S47, 1995.

Прочие труды, рекомендуемые к ознакомлению:

  1. Raisz, L.G., Yajnik, C.H., Bockman, R.S., and Bower, B.B.: Comparison of commercially available parathyroid hormone immunoassay in the differential diagnosis of hypercalcemia due to primary hyperparathyroidism or malignancy. Ann. Intern. Med. 91:739-740, 1979.

  2. Endres, D., Brickman, A., Goodman, W., Maloney, D., and Sherrard, D.: N-Terminal PTH radioimmunoassays in assessment of renal osteodystrophy. Kidney International. 21:132, 1982.

  3. Dambacher, M.A., Fischer, J.A., Hunziker, W.H., et.al.: Distribution of circulating immunoreactive components of parathyroid hormone in normal subjects and in patients with primary and secondary hyperparathyroidism: the role of kidney and of the serum calcium concentration. Clin. Sci. 57:435,1979.

  4. Kao, P.C., Jiang, N.S., Klee, G.G., and Purnell, D.C.: Development and validation of a new radioimmunoassay for parathyrin (PTH). Clin. Chem. 28:69, 1982.

  5. Endres, D.B., Villanueva, R., Sharp, C.F. Jr, Singer, F.R.: Measurement of parathyroid hormone. Endocrinol Metab. Clin. North Am. 18:611-629,1989.

  6. Kao, P.C., van Heerden, J.A., Grant, C.S., Klee, G.G., Khosla S: Clinical performance of parathyroid hormone immunometric assays. Mayo Clin. Proc. 67:637-645, 1992.

  7. Marcus, R.: Laboratory diagnosis of primary hyperparathyroidism. Endocrinol Metab. Clin. North Am. 18:647- 658, 1989.

Пересмотрено 29.07.2008